詳談各種酶活檢測方法

通常酶制劑活性的檢測是采用實驗室分析手段來進行評價，它可以用來篩選酶制劑、確定復(fù)合酶制劑的zui佳組方及確定產(chǎn)品的zui佳添加量等，酶制劑實驗室評價技術(shù)是目前飼料廠家應(yīng)用zui為廣泛的一種方法。其操作相對簡單，檢測所用時間短，便于生產(chǎn)實踐應(yīng)用。酶活測定結(jié)果雖不能*反映酶的使用效果，但通過檢測至少可以避免使用劣質(zhì)的酶制劑。我國飼料工業(yè)標(biāo)準中已經(jīng)確立了飼用植酸酶（GB/T 18634）、纖維素酶（NY/T912）、β-葡聚糖酶（NY/T 911）的測定方法。另外，許多企事業(yè)單位為了生產(chǎn)研究的需要也制定了很多用于各種酶制劑活力的測定方法。目前測定酶制劑活性的方法主要有：

1, 比色法

    比色法是以反應(yīng)生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法，根據(jù)原理不同可分為還原糖法和色原底物法。

2, 還原糖法    這種方法是通過酶作用于化學(xué)合成或從自然界提取出來的底物來進行測定的。非淀粉多糖酶與底物在特定的條件（溫度、pH值和底物濃度）下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為還原糖，在與顯色劑反應(yīng)后，通過比色確定還原糖的生成量，同時制作標(biāo)準曲線。酶的活性表示為單位時間產(chǎn)生一定濃度的產(chǎn)物所需要的酶量（mg 或mL）。該法可適用于大部分酶活力的測定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶等的測定。根據(jù)顯色劑的不同又可分為DNS 法、釩鉬酸銨法和地衣酚法。其中DNS 法由于操作簡單、顯色穩(wěn)定，是目前眾多實驗室和飼料企業(yè)在測定非淀粉多糖酶時應(yīng)用zui多的測定方法。

3, 色原底物法    原理是利用人工合成的含色原基團的底物在酶的作用下釋放出有色物質(zhì)，利用分光光度計比色測定有色物質(zhì)的含量計算酶活。如木聚糖酶活力的測定。該法操作簡單、重現(xiàn)性好，但酶作用于合成底物與天然底物的效果有一定區(qū)別，用合成底物測定的酶活并不能代表酶制劑在應(yīng)用于天然飼料時所能發(fā)揮的酶活大小。

4,  黏度法

    這種方法是根據(jù)酶能夠降低一定濃度的標(biāo)準底物（控制pH值、溫度等條件）的黏度的能力來確定酶的活性。利用的底物主要有化學(xué)合成的底物（如CMC 用于纖維素酶的測定） 和自然提取的底物（如小麥阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的測定）。測定的酶的活性值是通過與同時測定的標(biāo)準酶活性的比較，來確定酶的活性。該法可用于木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶等酶活測定。這種方法的特點是通過降低底物的粘度來反映酶的活性，這也正是酶在體內(nèi)起作用的重要特征。該法雖然靈敏度較高，但重現(xiàn)性差，操作復(fù)雜費時，應(yīng)用難于普及。

5,  免疫學(xué)法

    用于酶活性分析的免疫學(xué)法包括ELISA 法和免疫凝膠擴散法。這兩種方法是根據(jù)酶與抗體之間發(fā)生反應(yīng)，然后ELISA 法通過第二步反應(yīng)，凝膠擴散法則通過印染過程來確定酶的活性。

    這些方法非常靈敏，能夠檢測到極低水平的酶蛋白。但它們的缺點是對于每個產(chǎn)品的酶需要特殊的抗體，另外抗體能夠與非酶蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。由于抗體本身所用的蛋白質(zhì)是特定的，因此，由不同生產(chǎn)者生產(chǎn)的同種類型的酶之間是沒有交叉性的。另外，采用實驗動物的敏感性也值得探討。

6,  凝膠擴散法

    這種方法是將酶作用的底物與某種凝膠混合后倒入培養(yǎng)皿中，凝固之后，在凝膠上切開一條鑿，倒入標(biāo)準酶液和測試酶液。培養(yǎng)一定時間后，在切開的凝膠周圍能夠看到水解區(qū)域，區(qū)域的大小與酶的含量成正比。在某些情況下，還可以再加入其他試劑來顯示水解的區(qū)域。如木聚糖酶活力的測定。    這種方法雖然簡單，但培養(yǎng)時間長。因為這種方法是根據(jù)區(qū)域的大小來確定酶的活性，所以其準確性要低于其他非擴散的方法。

7,  比濁法

    以酵母或酵母細胞壁在緩沖溶液中的濁度或吸光度的降低來表示酶活力，如β-葡聚糖酶活力的測定。

8,體外模擬消化技術(shù)

    酶活測定畢竟不能反映外源酶在機體內(nèi)真實的作用效果，因此，對于體外法評定飼料營養(yǎng)價值的研究不斷增加。體外法評定飼料營養(yǎng)價值是通過模擬消化道內(nèi)溫度、pH、消化酶分泌、胃腸運動和養(yǎng)分吸收等參數(shù)，在體外建立一套與畜禽消化道內(nèi)環(huán)境接近的操作程序，對飼料及酶制劑進行營養(yǎng)價值預(yù)測和評定。常用的體外模擬消化技術(shù)包括：①胃蛋白酶—胰酶法；②胃蛋白酶—小腸液法；③胃蛋白酶—胰酶—瘤胃液法；④胃蛋白酶—胰酶—碳水化合物酶法。

    由于不同的飼料用酶是不同的微生物通過發(fā)酵過程產(chǎn)生的，酶產(chǎn)品的酶學(xué)性質(zhì)差別較大。并且各種微生物所分泌的酶的zui佳pH 值、溫度和對底物的親和性都不相同。而目前，飼用酶除植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶有正式頒布的國標(biāo)或行標(biāo)酶活測定方法外，其他飼用酶制劑目前都還沒有一個統(tǒng)一的定義及檢測標(biāo)準。因此，飼料廠家在比較不同廠家的酶制劑時，在沒有統(tǒng)一的測定方法情況下，應(yīng)首先確定自己認可的檢測方法，然后在*相同的測定條件進行檢測，這樣得出的結(jié)論才具有可比性。